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AMH結(jié)構(gòu)及免疫活性原料介紹

* 來源: * 作者: admin1 * 發(fā)表時(shí)間: 2018-05-09 10:59:51 * 瀏覽: 3470

抗繆勒氏管激素（AMH），也被稱為繆勒氏管抑制因子（MIF）,繆勒氏管抑制激素（MIH），繆勒氏管抑制物質(zhì)（MIS），是 140kDa，二聚體糖蛋白激素，是TGF-β超家族的一員。

一、背景

所有該家族的成員都是二聚體糖蛋白，在組織生長(zhǎng)和細(xì)胞分化中起不同的調(diào)節(jié)作用。跟家族的其他成員一樣，AMH蛋白的合成首先是作為一個(gè)大的前體，包含18個(gè)信號(hào)氨基酸序列，再加工成前激素原，最終生成同型二聚體。分泌前，成熟的激素經(jīng)歷糖基化和二聚體化，形成一個(gè)140kD的二聚體。二聚體由兩個(gè)完全一樣的70kD單體亞基，通過二硫鍵鏈接形成。每個(gè)單體由N端（即“pro”區(qū)）和C端（即“mature”區(qū)）組成。在細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，70kD的AMH的單體會(huì)在“pro”區(qū)和“mature”區(qū)間的特定位點(diǎn)水解形成兩段多肽：58kD的“pro”區(qū)和12kD的“mature”區(qū)。水解后，這兩段多肽仍會(huì)以非共價(jià)形式結(jié)合。

二、基因及蛋白組成

編碼AMH的基因位于19號(hào)染色的短臂上，AMH的氨基酸序列見下圖

三、早期AMH的檢測(cè)試劑

國(guó)外早期的AMH檢測(cè)試劑（如DSL/IOT/Beckman Gen II等），對(duì)不同形式的AMH（如天然、重組（加工過或?yàn)榧庸ぃ┯胁煌挠H和力。這些試劑的抗體即可以結(jié)合單體AMH也可以結(jié)合二聚體AMH，無法對(duì)其有效辨別。DSL/IOT兩種試劑，由于使用不同的抗體及不同的校準(zhǔn)品，在測(cè)定同一樣品時(shí)，會(huì)得出不同的檢測(cè)結(jié)果；有研究表明，Gen II的測(cè)試結(jié)果會(huì)比DSL的低20-40%；但Gen II申報(bào)數(shù)據(jù)表明，Gen II的測(cè)試結(jié)果會(huì)比DSL的高出40%。這些數(shù)據(jù)表明，AMH在某些條件下存在形式并不穩(wěn)定，且測(cè)試缺乏公認(rèn)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。這在一定時(shí)間內(nèi)限制了AMH在生殖評(píng)估、科研轉(zhuǎn)化等方面的應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)的AMH檢測(cè)主要以Beckman Gen II的ELISA結(jié)果為參考依據(jù)，如Roche cobas AMH即將檢測(cè)結(jié)果溯源至此。

四、AMH的結(jié)構(gòu)

AMH由兩個(gè)完全一樣的70kD單體亞基，通過二硫鍵鏈接形成。每個(gè)單體由560個(gè)氨基酸排列而成。一般情況下，同型二聚體或其他低聚體的亞基是對(duì)稱排列的。盡管有些例子表明，二聚體中的對(duì)稱性是可以被破壞的。在這種情況下，一個(gè)單體上可被抗體識(shí)別的位點(diǎn)，在另一條單體上可能無法被識(shí)別。目前，沒有理論或機(jī)理表明，AMH是一種對(duì)稱性被破壞的二聚體。因此，識(shí)別一條單體上位點(diǎn)的抗體，也可以識(shí)別另一條單體上的位點(diǎn)。

通過還原劑處理，二聚體AMH二硫鍵打開，AMH會(huì)形成兩條完全一致的單體。

在451氨基酸處，即—RAQR︱SAGA—存在水解位點(diǎn)，通過蛋白酶處理，全長(zhǎng)AMH將分為兩段多肽，1-451氨基酸為“pro”區(qū)，452-560氨基酸為“mature”區(qū)。

水解后的AMH自發(fā)聚合，可形成非共價(jià)結(jié)合的水解-再結(jié)合形式的AMH。

移除信號(hào)肽（1-18）和7個(gè)前肽，AMH會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段，一個(gè)有26-451氨基酸；另一個(gè)有452-560氨基酸。后者為AMH的mature片段。26-451還可以繼續(xù)處理為兩個(gè)片段，一個(gè)為26-229，這里稱為N-ter-pro區(qū)，另外的230-451這里稱為midpro區(qū)。

盡管目前對(duì)于AMH在臨床相關(guān)樣本中的形式尚不明確，但是已知在哺乳動(dòng)物代謝循環(huán)中可存在不同形式的AMH蛋白，在多種組織和細(xì)胞中也可確認(rèn)有不同形式的AMH蛋白。

五、AMH抗體配對(duì)選擇舉例

AMH存在不同的形態(tài)。針對(duì)不同區(qū)域位點(diǎn)的抗體配對(duì)，對(duì)不同形態(tài)的AMH檢出有所不同。下圖例舉了針對(duì)不同位點(diǎn)的抗體

A、B位于“pro”區(qū)，C、D位于“mature”區(qū)（A、B、C、D僅為所處區(qū)域的指示，不代表特定位點(diǎn)的抗體）。

AMH是對(duì)稱性排列的二聚體，在夾心法ELISA中，同一抗體即可作為捕獲抗體用，也可作為檢測(cè)抗體用，如C-C（如無特殊說明，前者均作為捕獲抗體，后者均作為檢測(cè)抗體）這一配對(duì)可作為AMH的mature-mature區(qū)檢測(cè)。由于針對(duì)同一位點(diǎn)，該配對(duì)的檢測(cè)不受樣本水解與否的影響。類似的，A-A可作為AMH的pro-pro區(qū)檢測(cè)。C-D可作為AMH的mature-mature區(qū)檢測(cè)。A-C可作為AMH的pro-mature區(qū)檢測(cè)。D-B可作為AMH的mature-pro區(qū)檢測(cè)。

把每一組配對(duì)都用于試劑來測(cè)量同一樣本中AMH含量。結(jié)果如下表所示

	C-C	A-A	C-D	A-C	D-B
Sample	6.553	0.369	12.012	23.525	>19
Calibrators(OD value)
Blank	0.086	0.069	0.093	--	0.062
0.1ng/ml AMH	0.106	0.076	0.133	--	0.08
10ng/ml AMH	1.26	1.178	2.94	--	1.5

不同配對(duì)的試劑被認(rèn)為測(cè)量樣本中不同的形態(tài)的AMH。C-C測(cè)量的是全長(zhǎng)二聚體和mature區(qū)二聚體的AMH。C-D mature-mature區(qū)檢測(cè)，測(cè)量的是全長(zhǎng)二聚體和單體，mature區(qū)單體和二聚體AMH。因?yàn)檫@一配對(duì)可檢測(cè)更多形態(tài)的AMH，所以測(cè)定的值要高于C-C的檢測(cè)。A-C的pro-mature區(qū)檢測(cè)，測(cè)量全長(zhǎng)二聚體和單體，不能被C-D識(shí)別的全長(zhǎng)和單體的AMH片段。因此，存在有的亞型可以被pro-mature檢出，但是不能被mature-mature識(shí)別。